Alto

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 572 (2023) Citar este artículo

1384 Accesos

20 altmétrico

Detalles de métricas

El ratón de laboratorio ha proporcionado información tremenda sobre los fundamentos de la fisiología del sistema nervioso central de los mamíferos. En los últimos años, ha sido posible obtener imágenes de neuronas individuales, células gliales y células vasculares in vivo mediante el uso de preparaciones fijadas en la cabeza combinadas con ventanas craneales para estudiar las redes locales de actividad en el cerebro vivo. Estos enfoques también han tenido éxito sin el uso de anestesia general, lo que proporciona información sobre los comportamientos naturales del sistema nervioso central. Sin embargo, todavía no se ha desarrollado lo mismo para el ojo, que está en constante movimiento. Aquí caracterizamos una nueva preparación fijada en la cabeza que permite obtener imágenes de la retina con óptica adaptativa de alta resolución a nivel unicelular en ratones que se comportan despiertos. Revelamos tres nuevos atributos funcionales del ojo normal que la anestesia pasa por alto: 1) Movimiento ocular del ratón de alta frecuencia y baja amplitud que sólo está presente en el estado despierto 2) El flujo sanguíneo unicelular en la retina del ratón es reducido bajo anestesia y 3) las retinas de ratón se espesan en respuesta a la anestesia con ketamina/xilazina. Aquí mostramos los beneficios clave de la preparación que se comporta despierto y que permite el estudio de la fisiología de la retina sin anestesia para estudiar la fisiología normal de la retina en el ratón.

El ratón de laboratorio es un modelo indispensable para la investigación biomédica debido a su tamaño, accesibilidad, catálogo genético secuenciado y capacidad para modelar aspectos de las enfermedades humanas. En particular, ha permitido estudiar la anatomía y función del ojo de los mamíferos, que, aparte del tamaño y la notable falta de fóvea, se parece en muchos aspectos al ojo humano1. Para lograr imágenes de la retina de alta resolución en el ratón, generalmente se requiere anestesia para estabilizar la preparación y suprimir el movimiento ocular, lo que hace que las evaluaciones funcionales a nivel celular sean casi imposibles2. Algunos enfoques han demostrado que es posible obtener imágenes de la retina del ratón con sujeción manual3,4; sin embargo, la utilidad de este enfoque es para fines fotográficos de una sola instantánea y no proporciona un eje óptico estable que es esencial para las medidas funcionales.

La administración de anestesia general proporciona una preparación estabilizada in vivo y mitiga el movimiento ocular; sin embargo, también puede alterar la función fisiológica normal, limitando así la interpretación de las mediciones in vivo, especialmente aquellas en la función del sistema nervioso central (SNC)5,6. Con este fin, los neurocientíficos fisiológicos y del comportamiento han desarrollado preparaciones fijadas a la cabeza para estabilizar el cerebro para electrofisiología y microscopía in vivo7, obviando la necesidad de anestesia. En particular, los estudios han informado varias diferencias neurofisiológicas clave en el estado despierto versus el estado anestesiado8,9. Otra consecuencia de la anestesia para la investigación de la visión es que elimina el movimiento ocular natural que proporciona contraste espaciotemporal al sistema visual. La supresión del movimiento natural del ojo cambia fundamentalmente la cinética espaciotemporal de la salida de las células ganglionares al núcleo geniculado lateral, el colículo superior y los estudios de la corteza visual en ratones10. También hay informes de que la locomoción en la preparación despierto cambia sustancialmente la respuesta fisiológica de la corteza visual11, aunque los mecanismos no se comprenden completamente. Por lo tanto, dejar intacto el movimiento ocular podría avanzar aún más en la comprensión del comportamiento oculomotor del ratón y, en particular, cómo el movimiento biológico del ojo puede afectar e impulsar la fisiología visual básica.

Además de los beneficios de preservar el movimiento ocular y eliminar los errores de la anestesia, obtener imágenes del ratón despierto también puede ayudar a obtener imágenes de la retina en varios aspectos adicionales. En primer lugar, obtener imágenes del animal despierto puede prevenir la opacificación óptica debido a una anestesia prolongada, lo que ha sido un tremendo desafío para las imágenes oculares en el ratón anestesiado12. En segundo lugar, la termorregulación no es necesaria cuando se obtienen imágenes del ratón despierto, lo que ha demostrado afectar la fisiología homeostática13. Y finalmente, el ratón despierto mantiene una claridad ocular normal parpadeando y refrescando constantemente la película lagrimal sin necesidad de lentes de contacto o lubricación, lo que podría confundir las condiciones ópticas naturales o de comportamiento14.

Aquí reconocemos muchos beneficios potenciales del estudio de la retina del ratón despierto en alta resolución sin anestesia y superamos varias de las limitaciones anteriores mediante el desarrollo y la caracterización de una preparación con sujeción de la cabeza para imágenes de la retina. Proporcionamos un aparato de código abierto totalmente impreso en 3D para sostener la cabeza del ratón y proporcionar una pupila estable con un cuerpo suspendido sobre un cilindro giratorio que permite la deambulación libre y la medición simultánea de la velocidad y el comportamiento ambulatorio. Medimos la estabilidad del eje óptico que facilita la obtención de imágenes de la retina estructurales y funcionales de alta resolución. Además, mostramos la utilidad al obtener imágenes del ojo del ratón con una oftalmoscopia láser de escaneo multimodal (SLO) y una tomografía de coherencia óptica (OCT) líderes en el mercado. Luego demostramos los beneficios de las imágenes de alta resolución utilizando un oftalmoscopio de luz de escaneo con óptica adaptativa personalizado (AOSLO) para visualizar varias estructuras celulares de la retina con una resolución a nivel de micras. La estabilidad del ojo y la calidad de la imagen en el ratón despierto están validadas para imágenes SLO y AOSLO. Utilizando imágenes AOSLO de escaneo de líneas de alta velocidad15,16, descubrimos un movimiento ocular similar a un microtemblor que antes se pasaba por alto. En este trabajo inicial, mostramos varias oportunidades científicas al resaltar tres cambios fisiológicos clave en la retina inducidos por la anestesia.

El enfoque general y la configuración se presentan en la Fig. 1a. El cráneo del ratón se mantuvo estable mediante una placa de cabeza fijada. La placa de cabeza en forma de Y se implantó en el centro del cráneo del ratón en paralelo al eje anteroposterior después de un único corte quirúrgico a través del cuero cabelludo bajo anestesia (Fig. 1b). Todos los ratones sobrevivieron al procedimiento. Los ratones con cabeza cubierta exhibieron un comportamiento normal y mantuvieron una apariencia exterior saludable con un pelaje arreglado y un nivel de actividad normal. No se observaron inflamación ni otros efectos secundarios relacionados con la implantación de la placa de cabeza. Los pesos de todos los ratones también se mantuvieron constantes antes y después de la cirugía. A los 3 días de la colocación quirúrgica de la placa de cabeza, los ratones con la cabeza sujeta se aclimataron al aparato durante cinco sesiones de entrenamiento que duraron entre 30 y 60 minutos. La placa de cabeza en forma de Y se montó en un brazo fijo suspendido sobre un cilindro giratorio de modo que los ratones pudieran deambular libremente hacia adelante y hacia atrás. Después del entrenamiento y la aclimatación en el aparato con cabeza fija, los ratones no mostraron aversión ni respuesta de retirada y mantuvieron un comportamiento de aseo normal (vídeo complementario 1), lo que indica además un estado inicial de calma sin signos externos de angustia17,18. La cirugía de la placa craneal dejó el ojo abierto con un reflejo de parpadeo normal (Video complementario 1).

a Preparación con cabeza sujeta para obtener imágenes de la retina de un ratón despierto y en comportamiento. Una placa de cabeza en forma de Y implantada quirúrgicamente en el cráneo del ratón restringe el movimiento de la cabeza, mientras que se permite la deambulación en un cilindro giratorio durante la toma de imágenes. b Esquema que muestra la posición de la placa de cabeza en el centro del cráneo del ratón en paralelo con el eje anteroposterior. c Una fotografía del ratón con la cabeza sujeta con SLO comercial. d Imagen cSLO multimodal de la retina en ratones despiertos con la cabeza sujeta. Se visualizan diferentes estructuras de la retina (de izquierda a derecha): la reflectancia y las imágenes autofluorescentes revelan los principales vasos sanguíneos superficiales de la retina y haces de fibras nerviosas debajo de los canales NIR (arriba) y azul (abajo). Co-registro fluorescente de angiografía con verde de indocianina excitada por NIR (ICGA) de redes de vasos sanguíneos superficiales (representadas en pseudocolor rojo) con células inmunitarias marcadas con fluorescencia excitadas en azul (representadas en pseudocolor verde) en un ratón transgénico CX3CR1. ICGA de la red de vasos sanguíneos coroideos profundos. e cubo OCT y una sección transversal representativa escaneada b fotografiada en un ratón despierto con la cabeza sujeta. f Las imágenes AOSLO muestran capacidades multimodales. Izquierda: imagen de reflectancia confocal que revela haces de fibras nerviosas y capilares retinianos. Medio: imágenes de contraste de fase de un microquiste y una rama de los vasos sanguíneos de la retina. Derecha: imagen de fluorescencia de una célula ganglionar de la retina marcada con YFP con dendritas y axones resaltados.

El aparato con sujeción de cabeza permitió obtener imágenes de retina estructurales y funcionales de alta calidad utilizando plataformas comerciales de imágenes SLO y OCT sin la ayuda de óptica adaptativa (Fig. 1d, ey Video complementario 3). Todas las principales modalidades de imágenes de fluorescencia, autofluorescencia y reflectancia fueron posibles utilizando el sistema comercial SLO + OCT (Heidelberg Spectralis, Heidelberg Engineering, Alemania). Utilizando reflectancia, se revelaron los principales vasos sanguíneos superficiales de la retina y haces de fibras nerviosas tanto bajo los canales NIR como bajo los canales azules. Los agentes de contraste de angiografía populares también podrían usarse en ratones despiertos para revelar angiografía con fluoresceína sódica (FA) con imágenes claras de arteriolas, vénulas y capilares de la circulación retiniana utilizando excitación de 488 nm y fluorescencia de paso largo de ~500 nm. La angiografía con verde de indocianina (ICGA) utilizando luz NIR reveló tanto la circulación superficial de la retina como una buena penetrancia para visualizar la circulación coroidea. Visualizar la coroides es un desafío notable en el ratón C57BL6/J ya que el EPR está densamente pigmentado. Para mostrar el potencial para obtener imágenes de fluorescencia marcada transgénicamente, también tomamos imágenes de microglía fluorescente utilizando ratones CX3CR1 con una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en células que contienen el receptor 1 de quimiocina CX3. En todas las modalidades de imágenes SLO (fluorescencia y reflectancia), el único El contraste de la imagen del fotograma y la relación señal-ruido (SNR) fueron suficientes para realizar el registro a una velocidad de fotogramas de hasta 8,8 Hz con el software de registro automático incorporado (vídeo complementario 2). El registro frontal permitió el registro de escaneo B en tiempo real para cubos OCT volumétricos y mejoró la SNR al promediar múltiples imágenes (ART, seguimiento automático en tiempo real)19. Tomamos imágenes de un cubo OCT 3D con 96 exploraciones B. Utilizando el registro en tiempo real y ART incorporados, el cubo OCT reveló una delimitación clara de las capas de la retina comparable a la lograda con anestesia a pesar de los cambios residuales de la mirada y el movimiento ocular durante la adquisición del cubo completo.

Un desafío importante para las imágenes de alta resolución de la retina del ratón despierta es que el haz de imágenes que ingresa a la pupila del ojo del ratón (~ 2 mm) es sensible al movimiento de la cabeza y los ojos. Las desalineaciones de las pupilas pueden provocar recortes y viñeteados que afectan seriamente la detección del frente de onda, desenfocan la imagen y crean una entrega/recolección de luz inestable para mediciones funcionales. Para la mayoría de las aplicaciones de alta resolución, es deseable una pupila completamente dilatada porque maximiza la apertura numérica (NA ~0,49), mejorando así la resolución de imágenes y la eficiencia de recolección de luz. Sin embargo, también crea un requisito de estabilidad para alinear la pupila óptica del instrumento con la pupila del animal. Para cuantificar la estabilidad del eje óptico para las imágenes de la retina, se tomaron imágenes de la pupila de salida del ojo en cinco ratones despiertos con SLO durante más de 20 minutos. La pupila fue rastreada y segmentada a partir de las imágenes SLO utilizando un software personalizado (Fig. 2a y Video complementario 3). Se rastreó la pupila del ratón para cuantificar el recorte espacial del haz basándose en un haz de imágenes simulado de 2,0 y 1,6 mm de diámetro (Fig. 2b, c). Con el haz de 2,0 mm, cuatro ratones mostraron una excelente estabilidad de la pupila con <1% de área promedio de la pupila recortada con el tiempo. Un animal presentó mayor recorte del haz (6,65%). Descubrimos que esto es un valor atípico debido a una cirugía de placa de cabeza subóptima que dejó una apertura ocular incompleta debido a una caída leve del párpado. Utilizando el haz de imágenes más pequeño de 1,6 mm, todos los ratones mostraron un recorte del haz insignificante, que representa 0,112 ± 0,18% del área de la pupila (media ± DE, n = 5 ratones). Para evaluar el impacto temporal del recorte del haz (la fracción de tiempo en que el haz fue recortado en >10%), evaluamos videos SLO capturados a 8,8 fotogramas por segundo (fps). Encontramos que el 94,75 ± 11,13 % de los marcos se soltaron para la viga de 2,0 mm (media ± DE, N = 5 ratones) y el 99,78 ± 0,30 % de los marcos se soltaron cuando se usó una viga de 1,6 mm. La pequeña fracción del recorte de la pupila en el análisis espacial o temporal se atribuyó principalmente al comportamiento de la mirada del ratón más que a la falta de estabilidad de la preparación de la placa de la cabeza. La estabilidad de la pupila también se examinó comparando la posición de la pupila con respecto a la velocidad de marcha registrada simultáneamente. No hubo correlación entre el recorte del haz o el centrado de la pupila con el comportamiento de locomoción. Esto sugiere que la estabilidad de la pupila se atribuyó a una placa frontal fija de manera estable (Fig. 2d). Tanto el análisis espacial como el temporal sugieren que la pupila es estable, incluso en condiciones de locomoción de hasta 0,8 m/s (aproximadamente ¼ de la velocidad máxima de un ratón sin restricciones). Por lo tanto, la preparación del ojo del ratón despierto se presta favorable para la obtención de imágenes continuas de la retina que facilitan la optofisiología funcional en condiciones más naturales.

a Imagen de una pupila de ratón capturada con SLO comercial. El círculo amarillo sólido indica el límite de la pupila del ojo rastreado. Los círculos cian sólidos y discontinuos indican respectivamente la baliza de imágenes simulada de 2 y 1,6 mm de diámetro de un sistema de imágenes de alta resolución. b El mapeo de la persistencia de la pupila revela una pupila estable durante 20 minutos cuando se utilizan pupilas del sistema de 2 mm (sólido) y 1,6 mm (discontinuo). c El eje y izquierdo muestra el recorte de la pupila en el área y el eje y derecho muestra la fracción de fotogramas sin recortar (<10% del área) durante la sesión de imágenes de 20 minutos (N = 8956 fotogramas). d No se observó una correlación obvia al correlacionar el movimiento de los ojos del ratón y la velocidad de la marcha, lo que muestra una estabilidad óptica constante sin importar el estado de deambulación del ratón.

Además del movimiento de la pupila, el movimiento ocular, incluidos los cambios de mirada y los parpadeos, puede alterar los métodos de obtención de imágenes estables. Por lo tanto, cuantificamos el cambio de mirada y el parpadeo mediante imágenes de la retina con SLO durante 20 minutos en cinco ratones despiertos. En comparación con los humanos, el comportamiento de parpadeo fue mucho menos frecuente en ratones (1,78 ± 0,8 parpadeos/minuto, n = 5 ratones) en comparación con el de los humanos (~20 parpadeos/min)20. La duración medida del parpadeo del ojo del ratón fue <340,9 ms, lo que corresponde a aproximadamente tres fotogramas en el sistema SLO. Los raros eventos de parpadeo en ratones facilitan la obtención de imágenes ininterrumpidas más allá de lo que es posible en las imágenes de la retina humana. Los cambios de mirada se cuantificaron mediante el seguimiento de las características de la retina en un campo de visión de 55° (8,8 fps). Los ratones vieron libremente la escena visual de la configuración experimental con movimientos oculares poco frecuentes pero dirigidos. Esto se midió sin orientación de la cabeza, ya que el aparato fijo en la cabeza restringía la mirada únicamente al movimiento de los ojos. La mayoría de los cambios de la mirada retiniana se produjeron en el eje horizontal, abarcando un rango observado de pico a pico de ±18,00˚ FOV en condiciones de visualización libre. Esto fue grande en comparación con ±3,44˚ de movimiento seguido en la dimensión vertical (Fig. 3a y Video complementario 3). Al igual que en estudios anteriores21, encontramos que los cambios de mirada predominantes eran >5˚, rápidos (~50˚/s) y raros (~7 por minuto en el ratón, en comparación con múltiples movimientos sacádicos por segundo en el ser humano). Como los ratones carecen de fóvea, estos cambios de mirada no son verdaderos movimientos sacádicos que vuelven a centrar la imagen en la fóvea22, sino que pueden representar una redistribución de la escena visual en áreas más densas con fotorreceptores o campos receptores de células ganglionares más pequeños que residen cerca del eje óptico. del ojo23. Tras veinte minutos de seguimiento de vídeo semicontinuo de la retina del ratón, el comportamiento de la mirada mostró un patrón agrupado de persistencia en varias direcciones de mirada preferidas, lo que sugiere una posición de descanso natural del ojo, o una dirección de mirada preferida basada en las características visuales dentro de la sala del laboratorio. Para determinar la persistencia de las posiciones de la mirada, los datos se dividieron y normalizaron a la posición media local cada 10 s. Utilizando este análisis, encontramos que la posición de la retina se mantuvo dentro de los 5˚ del ángulo visual el 80,02 ± 0,065% del tiempo dentro de las ventanas de 10 s, lo que corresponde a la ventana típica de adquisición de video de imágenes AOSLO de alta resolución. Esto es relevante para imágenes de alta resolución, ya que el campo subtendido para imágenes AOSLO suele ser de 5˚, lo que sugiere que el registro de imágenes fuera de línea puede corregir el movimiento mediante enfoques de registro de franjas o cuadros sin errores de "marco fuera" que hacen que el registro de imágenes se base en características comunes o enfoques de correlación cruzada desafiantes24.

a La posición de la mirada del ratón se mide mediante el seguimiento de los desplazamientos de la retina. Derecha: seguimiento de la posición de la mirada de un ratón con la cabeza sujeta durante 20 minutos superpuesto a un marco representativo de la retina. Izquierda: el trazo de movimiento de 20 minutos muestra cambios de mirada en direcciones horizontal (arriba) y vertical (centro). Velocidad de marcha registrada simultáneamente con un codificador giratorio en la rueda (abajo). b Posiciones de mirada de los cinco ratones normalizadas por cada ventana deslizante de 10 s durante 20 min. Los histogramas de distribución de la posición de la mirada superpuestos en los ejes horizontal y vertical muestran una alta probabilidad de desplazamientos retinianos <5° (etiquetados como un cuadro discontinuo) dentro de la ventana de imágenes de 10 segundos. c Correlaciones de la velocidad de la mirada del mouse y la velocidad de la marcha, el panel inferior muestra el acercamiento del conjunto de datos completo etiquetado como un cuadro gris en la parte superior para su visualización.

Los datos de locomoción también se registraron simultáneamente utilizando el codificador giratorio para investigar la posible correlación entre la locomoción y el comportamiento de la mirada. La velocidad de la marcha y el movimiento ocular tienen correlaciones negativas débiles, con la excepción del ratón número 4, que tuvo una correlación positiva débil. (R = 0,0226; 0,0030; 0,1294; 0,0060; 0,0135, respectivamente). No observamos ningún cambio obvio en el comportamiento de la mirada mientras los animales estaban en reposo o en movimiento (Fig. 3c). Esto sugiere no sólo grabaciones de imágenes estables independientes de la locomoción de los ratones, sino también una falta de movimiento ocular mejorado o suprimido en correspondencia con la marcha.

La escasez de parpadeos combinada con la estabilidad del eje óptico y la apertura de la pupila en el ojo del ratón que se comporta despierto hizo factible realizar detección y corrección del frente de onda utilizando óptica adaptativa de circuito cerrado. Utilizando la pupila de entrada de 2,0 mm del ojo dilatado del ratón, encontramos que los puntos de detección del frente de onda Hartman-Shack (HS) permanecieron brillantes y con una dispersión mínima que permitió la corrección durante más de 75 minutos (Fig. 4a-d). Esta preparación fue comparable a la preparación anestesiada óptima14,25. El punto HS estable y la posición de la pupila permitieron una corrección óptica adaptativa activa con un recorte de pupila insignificante. Los voltajes de corrección del frente de onda aplicados al espejo deformable estaban dentro del rango dinámico del espejo deformable, lo que indica una carrera suficiente. Con la corrección AO de circuito cerrado, el contraste de la imagen retiniana y la relación señal-ruido (SNR) se mantuvieron relativamente estables en grabaciones que duraron más de 1 h sin una degradación notable de la calidad de la imagen con el tiempo (Fig. 4e).

a, b Imágenes corregidas por AO en ratones anestesiados (a) y despiertos (b) durante 75 minutos. Arriba: Spotgrama de frente de onda de pupila capturado con HSWS. Medio: perfil de intensidad puntual media de la región marcada con el rectángulo naranja). Abajo: imagen de AOSLO. La intensidad de los patrones de puntos medios se normalizó respectivamente a la intensidad máxima en los puntos de tiempo 0 en los datos de vigilia y anestesia. c, d Comparando los perfiles de intensidad de los puntos promediados (etiquetados como líneas discontinuas en a, b) a los 0 min y 75 min. Todos los perfiles de intensidad se normalizaron respectivamente a sus valores máximos. En el ratón anestesiado, la mancha se ensanchó ligeramente en 75 minutos, mientras que el ratón despierto se mantuvo relativamente estable. e Gráfico de la intensidad máxima media a lo largo del tiempo. El ratón despierto mostró una intensidad máxima media relativamente estable, así como los ratones anestesiados con una preparación óptima.

Después de la corrección de AO, las imágenes AOSLO de alta resolución revelaron estructuras celulares de la retina en el ratón despierto, reflejando lo que era posible en estudios anteriores pero sin anestesia (Fig. 1f). Utilizando imágenes confocales NIR de 796 nm, fueron visibles estructuras como haces de fibras nerviosas individuales y capilares de menos de 5 µm14. Utilizando imágenes de contraste de fase NIR, se visualizaron estructuras translúcidas, como células sanguíneas individuales16 y paredes de vasos16. Esto permitió la medición del flujo sanguíneo sin etiquetas (descrita a continuación). Para mostrar las capacidades de fluorescencia, tomamos imágenes de las células ganglionares marcadas con Thy-1 YFP y sus cenadores dendríticos bajo una excitación de 488 nm. Las imágenes AOSLO de las tres modalidades de imágenes muestran un contraste y una resolución comparables a las capturadas previamente con ratones anestesiados. Todas las modalidades de imágenes de contraste de fase NIR, reflectancia confocal y fluorescencia se realizaron utilizando niveles seguros de potencia lumínica sin observar alteraciones del comportamiento en la luz de imágenes (200–500 µW en la córnea para NIR, 220–330 µW en la córnea para fluorescencia). Si bien no se espera que las longitudes de onda NIR sean visibles para los ratones, incluso el uso de longitudes de onda visibles brillantes no indujo un gesto de dolor o un parpadeo excesivo en el ratón, lo que sugiere que estos niveles de luz no inducen estrés manifiesto o fotofobia. El movimiento total del ojo en las direcciones preferidas de la mirada generalmente se mantuvo dentro de los 5° del movimiento de la retina, lo que significa que los errores de "encuadre" en el registro de la imagen fueron poco frecuentes. Se observaron y corrigieron las correcciones restantes de alta frecuencia y baja magnitud (video complementario 5).

Utilizando imágenes de AOSLO, descubrimos que el movimiento de la retina se caracterizaba por cambios de mirada, desviaciones lentas y un movimiento ocular de alta frecuencia y baja amplitud no informado previamente en el ratón despierto. La inspección visual de los datos de velocidad de video revela que los fotogramas individuales exhiben una rápida oscilación/corte dentro de fotogramas individuales (~40 ms, descrito más adelante) y movimientos de mirada más grandes que traducen el campo. Si no se corrige, dicho movimiento ocular provocará distorsión/desenfoque del movimiento, incluso si se obtienen imágenes con óptica de difracción limitada (vídeo complementario 5). Se implementó un registro basado en tiras paralelo al eje de escaneo rápido (15 kHz) para medir y corregir el movimiento línea por línea observado en las imágenes AOSLO del ratón despierto (Fig. 5a y video complementario 6). Para mostrar el beneficio del enfoque de registro basado en franjas/líneas, mostramos una corrección digital de posprocesamiento del movimiento ocular rápido con un contraste y una nitidez muy mejorados de las características detalladas en comparación con los datos sin procesar y el enfoque de registro de marco de cuerpo rígido ( Figura 5b). Todas las imágenes de fluorescencia presentadas aquí tienen suficiente contraste para realizar el registro de tiras en cada modalidad de imágenes de alta resolución sin requerir una estrategia de registro dual24. También trazamos un perfil transversal de características específicas del objetivo en cada modalidad que mostró una mejora en el contraste y la nitidez (Fig. 5c). El registro de la tira reveló detalles finos de las dendritas de las células ganglionares de la retina marcadas con YFP, contraste vascular, así como un mayor contraste de los haces de fibras nerviosas en la superficie de la retina (Fig. 5c). Además, la corrección del movimiento basada en tiras mejoró el contraste y la nitidez del contraste de movimiento, lo que revela con mayor precisión la perfusión del flujo sanguíneo, que es altamente sensible a los artefactos de movimiento27.

a Demostración del registro de tiras utilizando una célula ganglionar de la retina marcada con YFP obtenida de un ratón despierto con la cabeza sujeta. De izquierda a derecha: marco de referencia seleccionado manualmente con la menor distorsión, imagen AOSLO sin procesar distorsionada por los movimientos oculares, imagen registrada y el trazo del movimiento ocular en las direcciones horizontal y vertical. b Imágenes promediadas de cuatro modalidades sin registro (arriba), registro de cuadro (centro) y registro de tira (abajo). De izquierda a derecha: imagen fluorescente de una célula ganglionar de la retina marcada con YFP; imagen de contraste de fases de un vaso sanguíneo importante de la retina (vénula); imagen de contraste de movimiento del vaso sanguíneo; Imagen de reflectancia confocal de capilares y haces de fibras nerviosas. c Los perfiles de intensidad de tres estrategias de registro cuyas ubicaciones están etiquetadas como líneas discontinuas blancas en (b). A modo de comparación, las franjas grises indican el ancho de las características principales de una imagen, mientras que las flechas indican otras características menores. En b, c, el registro de la tira muestra un contraste de imagen y una relación señal-ruido mejorados en las cuatro modalidades de imagen.

Tanto en el SLO comercial como en el AOSLO personalizado, observamos un movimiento ocular rápido, pero de baja amplitud, que provocó que los fotogramas individuales exhibieran oscilaciones y cizallamiento dentro del fotograma (vídeo complementario 4, 5). Estos efectos se ven a menudo en dispositivos de escaneo o en aquellos con "obturador enrollable" cuando el movimiento excede la velocidad de fotogramas de la cámara. El movimiento no fue un artefacto del sistema de imágenes, ya que el efecto se silenció tras la administración de anestesia (video complementario 5). El movimiento del ojo en dirección ortogonal al vaso se puede cuantificar siguiendo la forma del perfil de corte (Fig. 6). Utilizando este enfoque, cuantificamos el movimiento ocular rápido que, hasta donde sabemos, no se ha observado en el ratón despierto (Fig. 6a, b y video complementario 8) 15, 16. Una transformada de Fourier del rastro del movimiento ocular (Fig. 6c) reveló dos picos prominentes en baja frecuencia, respectivamente, a 2 y 9 Hz. Estos picos corresponden a las frecuencias respiratorias28 y cardíacas29 características del ratón despierto. Sin embargo, también observamos una banda de potencia en las regiones de frecuencia más altas por encima de 150 Hz. La transformada de Fourier de la traza de la velocidad del movimiento ocular (Fig. 6d) muestra una banda de velocidad cercana a 100 Hz con un ancho de banda (30-150 Hz). En especies foveadas, esta banda de frecuencia es característica del temblor ocular30; sin embargo, aquí es notable que los ratones carecen de fóvea y tienen una agudeza visual de 0,5 c/deg31. La amplitud del movimiento ocular de alta frecuencia fue de ~6 µm, que es mucho menor que la resolución de los dispositivos oftálmicos convencionales, lo que puede explicar por qué se ha pasado por alto anteriormente.

a Medición de movimientos oculares de baja amplitud pero de alta frecuencia mediante imágenes escaneadas linealmente a través de un vaso sanguíneo (vena) importante de la retina. Izquierda: imagen cartesiana de la vena. La flecha negra indica la ubicación de las imágenes escaneadas con líneas. Derecha: imagen escaneada linealmente de la vena con el rastro de movimiento superpuesto como una línea blanca. b Arriba: rastro de temblor ocular de alta frecuencia resaltado mediante un filtro de paso alto (>30 Hz). Abajo: rastro de la velocidad del movimiento ocular. c Transformada de Fourier del trazo del movimiento ocular (sin filtrar). Se observaron potencias de hasta 200 Hz. Se observaron dos picos prominentes de baja frecuencia, respectivamente, a 2 Hz (120 bpm) y 9 Hz (540 bpm), a los que pueden contribuir los latidos respiratorios y cardíacos. d Transformada de Fourier de la velocidad del movimiento ocular. Se observó una potencia elevada a 30-200 Hz, lo que indica el ancho de banda del temblor ocular.

Bajo anestesia, es raro que se puedan obtener imágenes del ojo del ratón durante más de 2 h seguidas debido a la tolerancia de la anestesia, el desarrollo de opacificación anterior o la probabilidad de recuperación después de una anestesia sostenida32,33,34. Por lo tanto, la preparación despierto permite sesiones de imágenes semicontinuas que duran muchas horas. Para demostrar esta capacidad y calidad de las imágenes en intervalos prolongados, se tomaron imágenes del mismo ratón despierto y comportándose durante 10 horas consecutivas con un intervalo de 1 h (Fig. 7a). El tiempo de obtención de imágenes de 10 h abarcó los períodos normales de vigilia y sueño del ciclo circadiano de luz-oscuridad (las primeras 4 h corresponden a las horas de luz en el vivero y las 6 h restantes corresponden a las horas de oscuridad). A pesar de los cambios ocasionales de la mirada que cambian naturalmente el campo de imagen, podríamos regresar al mismo campo de imagen con una precisión <3˚ ajustando manualmente la orientación del mouse para brindar coherencia en cada sesión de imagen (Fig. 7b y video complementario 7). Para mostrar una de esas aplicaciones, estudiamos el movimiento ocular de alta frecuencia en función de la hora del día durante 10 h. La amplitud del movimiento ocular rápido fue constante durante 10 h con una media de 5,95 µm o 10,50 minutos de arco (Fig. 7c). Los espectros de potencia del punto de todos los tiempos también sugirieron un ancho de banda de frecuencia constante de la velocidad de movimiento (Fig. 7d, ey Video complementario 9).

una imagen AOSLO longitudinal de 10 h en el mismo ratón despierto y con la cabeza sujeta. Las imágenes duraron 11 h, con una sesión de imágenes de 10 minutos cada 1 a 1,5 h. Se mostraron imágenes cartesianas AOSLO representativas de la misma vena en cada sesión. b El montaje de imágenes cartesianas con bordes codificados por colores con marcas de tiempo muestra la capacidad de navegar y localizar la misma vena en diferentes sesiones de imágenes durante 10 h. c Amplitud media del temblor ocular medida a partir de los datos escaneados linealmente de la misma vénula durante 10 h. La barra de error indica la desviación estándar de la amplitud del movimiento ocular en todos los puntos de tiempo (N = 15.000 líneas). d FT de la traza de velocidad del movimiento ocular que muestra espectros de potencia idénticos durante 10 h con un ancho de banda constante de 30 a 200 Hz. e Otra vista en perspectiva de los mismos datos que en (d). La línea gris superpuesta muestra el promedio de todos los espectros de potencia.

El movimiento ocular de alta frecuencia se midió en un ratón primero en estado despierto y luego después de la inyección de K/X durante aproximadamente 2 h. Observamos que el movimiento ocular de alta frecuencia se eliminó rápidamente después de la inducción de la anestesia (Fig. 8a, by Video complementario 10). La cuantificación de este efecto se muestra en la Fig. 8; sin embargo, la atenuación visible del movimiento de alta frecuencia también es evidente en el vídeo complementario 5, donde se muestran las mismas ubicaciones de la retina a los pocos minutos de la inyección de K/X. El movimiento ocular fue <10 µm durante 80 minutos, lo que sugiere que no solo se suprimen los cambios posicionales de la mirada, sino que también se suprimen los movimientos similares a los temblores de alta frecuencia. Ochenta minutos después de la inyección de K/X, se observaron ligeros espasmos y movimientos en la cara. Tanto el movimiento ocular rápido como el dependiente de la mirada regresaron gradualmente a las condiciones iniciales (Fig. 8c).

a La medición del movimiento ocular muestra la ausencia de movimientos oculares bajo anestesia profunda, luego reaparece bajo anestesia superficial pero con menor velocidad en comparación con el estado despierto. El código de color indica el lapso de tiempo de la imagen, donde el verde es el estado despierto, el magenta es el estado de anestesia profunda y el cian es el estado de anestesia superficial. b Perfiles de velocidad de movimiento ocular yc Su espectro de potencia en cada punto de tiempo revela relativamente no solo una velocidad más baja sino también un ancho de banda de frecuencia más bajo bajo anestesia superficial en comparación con el estado despierto.

El flujo sanguíneo se midió utilizando la técnica descrita anteriormente en ratones con reposacabezas15. Brevemente, cuando se realizan imágenes escaneadas linealmente a través de un vaso sanguíneo, las células sanguíneas que fluyen generan una trayectoria en ángulo en la imagen espacio-temporal, lo que indica un cambio en la posición a lo largo del tiempo escalado por el ángulo de incidencia del haz a través del vaso15. La velocidad de las células sanguíneas se puede cuantificar midiendo la pendiente de los perfiles de las células sanguíneas (Fig. 9a y Fig. S6). Se encontró que el flujo era pulsátil (Fig. 9b), pero a diferentes frecuencias y velocidades correspondientes a una frecuencia cardíaca variable con anestesia (481 y 758 Hz en dos ratones despiertos), correspondientes a frecuencias cardíacas mucho más altas35 en comparación con las medidas en ratones anestesiados ( 271,2 ± 1,2 Hz, n = 5 vasos sanguíneos de tres ratones). El flujo sanguíneo en una sola vénula se redujo en un 43% en relación con la medida inicial (1,56 a 0,89 µL/min) 20 minutos después de la anestesia (Fig. 9c). Las medidas independientes mostraron un estrechamiento abrupto del diámetro del vaso justo después de la inyección de K/X, mientras que el cambio en la velocidad de la sangre fue menor al principio pero disminuye sustancialmente con el tiempo después de 20 minutos de inyección de K/X. Estos dos parámetros no mostraron cambios equivalentes, lo que subraya la importancia de las mediciones directas para revelar una imagen completa del flujo sanguíneo y su regulación36. Si bien el movimiento ocular (discutido anteriormente) regresa gradualmente 80 minutos después de la inducción de K/X, el flujo sanguíneo permaneció bajo (0,66 µL/min), que fue un 58 % por debajo del valor inicial. Estos hallazgos sugieren que el retorno del movimiento ocular precedió al retorno del flujo sanguíneo retiniano, lo que indica que el retorno de la función fisiológica se produce a diferentes velocidades en el mismo ratón después de la anestesia K/X. Las mediciones de flujo de los ratones despiertos (n = 5 vasos de tres ratones) también se compararon con los datos informados previamente de nuestro grupo en ratones anestesiados (n = 123 vasos de 20 ratones, Fig. 9d)15,19. A pesar de que los vasos individuales se redujeron con la velocidad bajo anestesia, encontramos que, en general, la relación entre el flujo y el diámetro del vaso fue generalmente similar. Las curvas de flujo-diámetro del modelo ajustado (detalladas en Métodos) muestran diferencias generales menores en el flujo sanguíneo total.

a Imagen escaneada linealmente del mismo vaso sanguíneo grande en la retina de un ratón en los estados de anestesia (arriba) y despierto (abajo). Las células sanguíneas individuales detectadas se etiquetaron con líneas cuyo código de colores representa sus velocidades. b Velocidades de flujo sanguíneo medidas según los datos que se muestran en (a). Se observó pulsátil tanto en los datos de vigilia como en los de anestesia. Se observaron una mayor frecuencia cardíaca y velocidad de flujo en el ratón despierto. c El flujo sanguíneo medido en un vaso a lo largo del tiempo muestra la supresión del flujo sanguíneo bajo anestesia. d El flujo sanguíneo unicelular medido en ratones despiertos (verde, n = 5 vasos, 3 ratones) se compara con una población de ratones anestesiados (púrpura, n = 123 vasos, 20 ratones). Las curvas del modelo flujo-diámetro se ajustan a los datos.

Medimos la morfología de la retina que variaba desde el estado despierto hasta el estado anestesiado mediante OCT en cuatro ratones. A todos los ratones se les tomaron imágenes en el cuadrante temporal superior del ojo derecho con un campo de visión de 30°. Observamos que los ratones sometidos a anestesia mostraron un engrosamiento retiniano sustancial durante dos horas, mientras que los ratones en estado despierto no lo hicieron (Fig. 10a). El espesor total de la retina (TRT) se cuantificó mediante un software personalizado a partir de los cubos 3D OCT (Fig. 10b); las mediciones de cada punto de datos se muestran en la Fig. S8. Entre 80 y 110 minutos después de la inyección, el espesor de la retina en ratones anestesiados alcanzó un aumento máximo de 8,0 ± 4,1 μm (n = 4 ratones) con un engrosamiento promedio de 3,9 ± 2,0% (p = 0,034, Fig. 10c), aunque no fue significativo. Se observó engrosamiento en las retinas de ratones de control despiertos (p = 0,179, n = 4 ratones). El efecto espesante continuó progresando en el último momento de la medición. El mapa frontal del cambio de TRT también sugirió que dicho efecto de engrosamiento era uniforme en las regiones y excentricidades de la retina (Fig. 10d, e).

a Imagen de retina de ratón OCT longitudinal en estado despierto y anestesiado. Se observó un engrosamiento de la retina asociado con el lapso de tiempo posterior a la inyección de la anestesia K/X. b Espesor total de la retina (TRT) medido a partir de los cubos OCT. Muestra un efecto espesante sustancial después de 60 minutos después de la inyección de la anestesia KX. c Las mediciones de N = 4 (media ± DE) ratones muestran un engrosamiento significativo relacionado con la inyección de KX (prueba t de Student bilateral). d La evaluación de los cambios de TRT versus tres rangos de excentricidad en la retina no muestra diferencias significativas (gráfico de líneas negras, media ± DE, N = 4 ratones). e Los mapas en face del cambio de TRT tampoco muestran diferencias locales notables relacionadas con regiones o estructuras de la retina.

La preparación del ratón con cabeza sujeta facilita un eje óptico estable a través del cual se pueden obtener imágenes de mediciones estructurales y funcionales a escala celular del ojo del ratón despierto con modalidades de imágenes oftálmicas estándar y de alta resolución. La creación de este eje de imágenes oculares estable aún permite la libre deambulación del ratón, lo que reduce el estrés del confinamiento y además permite una puerta de entrada para estudios de comportamiento e interacción visual del ratón con entornos con o sin anestesia. Esto permite un nuevo dominio de investigación de la retina en el ratón que puede examinar y/o corregir el impacto de la anestesia en las imágenes de la retina, ya que muchos estudios han examinado dicho impacto en la corteza5. Para demostrar un aspecto del impacto de la anestesia, por primera vez hemos caracterizado y comparado las mediciones del flujo sanguíneo tanto en estado despierto como anestesiado en los mismos ratones. Al medir el flujo sanguíneo retiniano (RBF), demostramos que la anestesia KX suprime el flujo sanguíneo. Esto confirma la evidencia de estudios anteriores9,37, pero ahora proporciona una resolución a nivel de micrones, que es fundamental para mediciones precisas del flujo sanguíneo que se encuentran dentro de vasos mucho más pequeños que 3-45 micrones en el ratón15. Este trabajo es esencial para comprender los fundamentos del acoplamiento neurovascular y la regulación del flujo microvascular en modelos de enfermedades que se estudian mejor sin el impacto de la anestesia, que puede confundir o atenuar la dinámica y el estado inicial. También encontramos que la anestesia KX induce un engrosamiento retiniano apreciable medido por OCT. Hasta donde sabemos, no se ha informado de tal engrosamiento progresivo y los mecanismos no están claros. Si bien es especulativo, postulamos que el espesor de la retina observado y el cambio del FSR pueden verse afectados por cambios en la presión intraocular38 que pueden modularse con la anestesia KX39. También se ha descubierto que la anestesia KX induce depresión de la frecuencia cardíaca y respiratoria y disminuciones en la presión arterial media, lo que podría inducir un cambio en el RBF40. Si bien se necesita más trabajo para informar la naturaleza de tales cambios, este hallazgo subraya la importancia de realizar tales mediciones en estado despierto, ya que la anestesia puede distorsionar la interpretación de las mediciones de la enfermedad en ratones in vivo, especialmente porque puede confundir las interpretaciones convencionales de la retina. Pérdida/supervivencia celular.

Vale la pena reflexionar que si bien los estudios de imágenes de la retina in vivo se han esforzado por eliminar el movimiento ocular con el objetivo de obtener una plataforma de imágenes estable, esto tiene la consecuencia de eliminar la entrada natural al ojo. Aquí, reconocemos que dejar intacto el movimiento ocular natural brinda la oportunidad de comprender mejor cómo el movimiento ocular y el sistema visual trabajan juntos para proporcionar visión al organismo41. Para demostrar uno de esos ejemplos, mostramos imágenes activas durante el comportamiento de mirada libre del ratón despierto. Al igual que los humanos, existe una preferencia temporal-nasal cuando el ratón explora el horizonte visual21. También encontramos que los ratones prefieren posiciones de mirada (Fig. 3) a pesar de carecer de la capacidad de fijación que normalmente se atribuye a los mamíferos foveados21. En una escala más fina habilitada por AOSLO de alta resolución espaciotemporal, revelamos un movimiento ocular de alta frecuencia y baja amplitud con una frecuencia temporal similar al microtemblor ocular humano (OMT). Provocativamente, la amplitud del movimiento ocular rápido en ambas especies corresponde aproximadamente a la mitad del tamaño de la agudeza visual máxima reportada30. En estudios futuros, será interesante ver si este movimiento ocular podría ser una característica conservada de la visión de los mamíferos que aumenta con el tamaño del campo receptivo o la agudeza visual. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de este movimiento de alta frecuencia y baja amplitud en el ratón (Fig. 6). La incorporación de esta información visual retiniana dinámica podría tener consecuencias notables para la caracterización espaciotemporal de los campos visuales receptivos en el ratón que abarcan desde la retina hasta la corteza42,43,44. Mostramos que dicho movimiento ocular se mantiene durante 10 h a lo largo del ciclo circadiano día/noche (Fig. 7). Es importante destacar que este movimiento ocular de alta frecuencia se elimina con la aplicación de anestesia, lo que es beneficioso para obtener imágenes de alta resolución (eliminando el desenfoque por movimiento); sin embargo, también elimina esta información como entrada natural a la velocidad de vídeo o a estímulos visuales estáticos. Investigaciones adicionales pueden revelar un requisito común de la visión de los mamíferos para incorporar movimientos oculares intencionados a esta escala microscópica para mejorar el contraste espaciotemporal del sistema visual30,41. En consonancia con este interés, el impacto de la marcha ha indicado, en algunos estudios, un aumento aparente en la agudeza visual y la ganancia de respuesta de ciertas neuronas visuales asociadas con la locomoción en el ratón45 que ahora pueden estudiarse a nivel de la retina. También consideramos que las mediciones de movimientos oculares de baja amplitud y alta frecuencia podrían proporcionar un biomarcador nuevo y útil para enfermedades neurodegenerativas en numerosos modelos de ratón que buscan cuantificar la integridad de los circuitos neuronales responsables del control del movimiento ocular46. Finalmente, vale la pena señalar que más allá del estudio de dichos movimientos oculares en la búsqueda de comprender la función y el control neuronal, tener en cuenta y corregir el movimiento ocular es esencial para lograr imágenes de alta resolución de la retina. Si no se corrige, inducirá desenfoque de movimiento en modalidades de imágenes de alta resolución con tiempos de exposición superiores a ~5 ms (velocidad de fotogramas de 200 Hz). Y si bien la fotografía con flash podría mitigar ese desenfoque, hasta la fecha existen pocos oftalmoscopios de adquisición de video que alcancen estas velocidades de obtención de imágenes, especialmente para el mouse. Esto significaría que incluso con una óptica perfecta, la imagen de la retina en estado de vigilia sería borrosa en una escala de 10 a 20 micrómetros. Por lo tanto, las imágenes de alta resolución deben lograr tanto la corrección de la aberración como la imagen/registro de alta velocidad >200 Hz para lograr un potencial limitado por la difracción en el ratón despierto.

Renunciar a la anestesia también tiene una gran ventaja en el estudio de la fisiología in vivo durante intervalos de tiempo más largos. Hasta la fecha, los estudios en ratones se han centrado en imágenes de retina anestesiadas que se limitan en gran medida a 30 a 120 minutos. Esto se debe a la intolerancia a la anestesia (mala supervivencia de los animales) o a la formación transitoria de cataratas cuando se obtienen imágenes durante períodos más prolongados. Aquí mostramos que es posible realizar un protocolo de imágenes semicontinuo que permite obtener imágenes del mismo animal durante más de 10 horas o más. Es posible realizar grabaciones completamente continuas si las preguntas científicas correctas lo justifican; sin embargo, se recomiendan descansos para que los animales se recuperen en su jaula para comer, descansar y dormir. Este paradigma abre una enorme ventana temporal para investigar con precisión los desafíos fisiológicos en la escala de horas, si no de días. Por ejemplo, los cambios circadianos, la respuesta a la terapia farmacológica, el movimiento de las células inmunitarias36, la modulación de la glucemia sistémica y los regímenes de ejercicio47 ahora se pueden estudiar en el transcurso de segundos a horas en una sola sesión, y de forma semicontinua durante días sin toxicidad acumulada de la anestesia o complicaciones de las opacidades anteriores que clásicamente han limitado dicho estudio requiriendo anestesia.

El ratón de laboratorio se encuentra entre los modelos más populares utilizados para recapitular aspectos de las enfermedades humanas, y aquí acercamos el modelo un paso más para capturar la fisiología normal del ojo de los mamíferos al obviar la necesidad de anestesia. Para que este enfoque esté disponible a nivel mundial, se proporciona una solución imprimible en 3D de bajo costo que se puede replicar en cualquier laboratorio que tenga acceso a una impresora 3D y a piezas de libre mercado. Este diseño está destinado a proporcionar una prueba de concepto y democratizar las mediciones oculares estables en el ratón sin anestesia. Existen innumerables aplicaciones que pueden aprovechar este trabajo y que tienen el potencial de mejorar nuestra comprensión de los fundamentos de la visión, el comportamiento, la estructura neuronal, la integridad funcional y la fisiología básica de la visión del ratón. Esperamos que algunas de las primeras aplicaciones analicen el impacto de la anestesia en una serie de funciones fisiológicas básicas. Otros pueden utilizar las capacidades de resolución y seguimiento de la retina para mejorar los registros rápidos y microscópicos de la posición de los ojos en entornos visuales simulados o de visualización libre. Sostenemos que las comparaciones de la fisiología visual entre el ratón y el hombre son ahora aún más estrechas al obviar la necesidad de anestesia que rara vez se utiliza en imágenes oftálmicas clínicas. Finalmente, el valor de una evaluación a largo plazo que dure de horas a días permitirá un nuevo régimen de estudio de la fisiología y la estructura a lo largo de una nueva ventana de tiempo que es de importancia crítica para la respuesta a la terapia, los ciclos circadianos y los cambios más graduales que de lo contrario se perderían debido a los desafíos logísticos de las ventanas de imágenes limitadas limitadas por la anestesia. En conjunto, esperamos que esto represente el comienzo de nuevos e interesantes estudios en estudios neuronales y de comportamiento en ratones, uno de los socios más poderosos en la investigación biomédica.

La cabeza del ratón estaba sujeta por una abrazadera que sostenía un brazo colocado lateralmente de su placa de cabeza en forma de Y implantada quirúrgicamente. La placa de cabeza se colocó verticalmente sobre una rueda (90 mm de diámetro) de modo que el ratón pueda deambular libremente con una postura y un modo de andar naturales durante la toma de imágenes. La colocación lateral de la pinza también permite obtener imágenes factibles del ojo contralateral. La abrazadera constaba de dos piezas entrelazadas impresas en 3D para crear un ajuste perfecto alrededor de la placa de cabeza, lo que garantizaba un reposacabezas estable a pesar de que solo se sujetaba por un lado. Todos los componentes de la plataforma de la rueda, excepto el cojinete y el eje, se imprimieron en 3D con ácidos polilácticos (Ultimaker, Ultimaker BV, Utrecht, Países Bajos). Se conectó un codificador rotatorio (ENS1J-B28 L00256L, Bourns, Inc, Riverside, CA, EE. UU.) al eje de la rueda, lo que les permitió girar en sincronización. La salida del codificador fue adquirida por una placa de adquisición de datos (USB-6001, National Instruments, Austin, TX, EE. UU.). La distancia y la velocidad de la marcha se extrajeron de las señales de salida del codificador con MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc., Massachusetts, EE. UU.). Los datos de locomoción se sincronizaron fuera de línea en función de las marcas de tiempo de los datos de imágenes adquiridos simultáneamente. Los archivos de impresión 3D y las instrucciones detalladas de montaje están accesibles públicamente en "https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.git".

Todos los estudios con animales se realizaron según las directrices del Instituto Nacional de Salud y fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones C57BL/6J se adquirieron en The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Para los experimentos se utilizaron doce ratones de entre 6 y 10 meses de edad. Todos los animales se alojaron en las instalaciones para animales de laboratorio The Vivarium del Centro Médico de la Universidad de Rochester en un ciclo de luz y oscuridad de 12 y 12 h con comida y agua ad libitum.

El protocolo cronológico de implantación de la placa de cabeza y entrenamiento de animales se muestra en la Fig. S1. Se administró una inyección subcutánea de buprenorfina (0,5 a 1 mg/kg) 24 h antes de la cirugía. El día de la cirugía, los ratones fueron pesados, anestesiados, transferidos a un marco estereotáctico para animales pequeños (modelo de la serie 900, David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.) y asegurados con las barras para las orejas y la barra incisiva para un cráneo plano. Primero se afeitó la superficie dorsal de la cabeza y luego se limpió la piel con una gasa de preparación con alcohol isopropílico al 70 % (número de catálogo: MDS090735, Medline, Northfield, IL, EE. UU.). Se realizó una incisión en la línea media desde la base del cráneo hasta el hueso frontal entre los ojos, de aproximadamente 2 a 3 cm de longitud. Luego se realizaron incisiones laterales en el lugar donde el músculo temporal se inserta en el cráneo. La fascia suprayacente se eliminó suavemente mediante disección roma e irrigación frecuente para exponer la superficie del cráneo. Luego se sujetó firmemente una placa de cabeza impresa en 3D en forma de Y sobre el cráneo aplicando una mezcla de cemento dental (Jet XR Shadow Powder, Lang Dental, Wheeling, IL, EE. UU.) y pegamento de cianoacrilato (proporción 2:1) (Krazy Glue Maximum Bond , Krazy Glue, EE. UU.). La placa de cabeza debe estar centrada sobre la intersección de la sutura coronal y el bregma, con un brazo medial alineado con la línea media hacia el hueso nasal. Los ratones se colocaron en una vivienda individual con casas de cartón para que se recuperaran durante 3 días después de la cirugía. En general, la salud de los ratones se controló todos los días mediante la observación visual de la apariencia del pelaje y el nivel de actividad. Después de la recuperación, se realizaron al menos cinco sesiones de entrenamiento de 30 a 60 minutos para aclimatar a los ratones a la plataforma de imágenes con cabeza sujeta. Se controló el peso del ratón en cada sesión de entrenamiento. En las dos primeras sesiones, los ratones fueron anestesiados superficialmente con una mezcla de ketamina-xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina) y luego se recuperaron con la cabeza sujeta en la plataforma para permitir la familiarización. Después de la recuperación, se permitió al ratón deambular durante 30 a 45 minutos. Estas dos sesiones de entrenamiento se realizaron con 24 h de diferencia para evitar la aplicación consecutiva de anestesia. Se realizaron tres o más sesiones de entrenamiento posteriores de 45 minutos sin anestesia, lo que permitió a los ratones aclimatarse a la condición del reposacabezas en estado completamente despierto. Los ratones que muestran una marcha y una postura estables, así como características de comportamiento relajadas, como el aseo, se consideran aclimatados y listos para las imágenes.

Al tomar imágenes con el ratón que se comportaba despierto, no se aplicaron procedimientos adicionales en el ojo excepto la dilatación de la pupila. La dilatación de la pupila se aplicó en ratones despiertos o anestesiados, lo que se logró colocando gotas para los ojos de tropicamida al 1% (Sandoz, Basilea, Suiza) y fenilefrina al 2,5% (Akorn, Lake Forest, Illinois, EE. UU.). Las imágenes se realizaron en un ambiente oscuro con una fase de adaptación a la oscuridad de 10 a 15 minutos antes del inicio de cada sesión de imágenes. Debido a que el ajuste del eje de rotación del rodillo con el mouse era limitado en nuestra plataforma, el FOV de las imágenes AOSLO se encontraba principalmente en el cuadrante superior de la retina. Al tomar imágenes de ratones anestesiados, se aplicó una inyección intraperitoneal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (dosis de 100 mg/kg) y xilazina (dosis de 10 mg/kg). Se utilizó una almohadilla térmica externa y un termómetro de sonda rectal (Physiosuite, Kent) para monitorear y mantener una temperatura corporal de 37,0 ˚C para los ratones anestesiados. Para prevenir la opacificación ocular inducida por la deshidratación bajo anestesia, se colocó una lente de contacto (Advanced Vision Technologies, Lakewood, Colorado, EE. UU.) sobre el ojo del que se tomaron imágenes y una lágrima artificial (GenTeal, Alcon Laboratories, Inc, Fort Worth, Texas, EE. UU. ) se aplicó de forma rutinaria cada 20 minutos durante la obtención de imágenes.

Las imágenes SLO y OCT se realizaron con una plataforma comercial de imágenes de retina multimodal (HRA Spectralis, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania). Tanto las imágenes OCT como SLO se capturaron con el objetivo FOV de 30°, a menos que se especifique lo contrario. La resolución de píxeles de SLO era 1536 × 1536, mientras que los cubos OCT tenían 1536 × 596 × 97 vóxeles. El campo de visión frontal del cubo OCT fue de 20° × 20° y con registro mediante la función incorporada de seguimiento automático de retina (ART). Cada corte de OCT también se promedió durante 40 fotogramas para mejorar la relación señal-ruido.

El AOSLO multicanal se describió en la literatura anterior14. Permite obtener imágenes de la retina con modalidades que incluyen imágenes confocales de reflectancia, contraste de fase y fluorescentes. Las imágenes de reflectancia confocal y contraste de fase se realizaron con un diodo láser superluminiscente de 796 nm con un ancho de banda de 17 nm (200–500 µW en la córnea, S790-GI-15, Superlum, Irlanda), mientras que un diodo láser de 488 nm (220–330 µW en la córnea, iChrome MLE, Toptica Photonics, Farmington, NY, EE. UU.) como fuente de excitación para imágenes fluorescentes. Se utilizó un orificio ADD 2.1 en el plano de imagen del canal NIR para obtener imágenes de reflectancia confocal y contraste de fase. Para proporcionar imágenes de contraste de fase, el orificio se desplazó lateralmente durante aproximadamente 22 ADD (Guevara, 2020). Se aplicó un sensor de frente de onda Hartmann-Shack (HSWS) para medir el frente de onda del ojo del ratón en tiempo real. Combinado con el espejo deformable (DM97-1, ALPAO, Montbonnot-Saint-Martin, Francia), la aberración inherente en el ojo del ratón se corrigió en bucle cerrado.

Al centrarse en los párpados y el canto, se obtuvieron imágenes de la pupila de salida del ojo del ratón utilizando NIR SLO a una velocidad de 8,8 fps con 768 × 768 píxeles. Las imágenes se realizaron en cinco ratones con cabeza sana en estado despierto. Cada sesión de imágenes duró aproximadamente 20 minutos y se grabaron 17 videos con la duración máxima permitida por el sistema (59,88 s), con intervalos que variaron de 5 a 30 s dependiendo del tiempo de almacenamiento en búfer de los datos entre dos adquisiciones. Se utilizó un algoritmo de seguimiento de pupila personalizado escrito en Matlab para rastrear automáticamente la región de la pupila del vídeo SLO. Se utilizó una estrategia de segmentación basada en texturas (Fig. S2). Primero, se aplicó un filtro de desviación estándar (STD) a la imagen para resaltar la región de la pupila, mientras que la pupila tiene una variación espacial menor en comparación con los tejidos circundantes, como el párpado y el pelaje. Luego, el mapa espacial de STD se binarizó con un umbral (STD <0,25) y la región de la pupila se segmentó con un algoritmo de cuenca hidrográfica. Finalmente se dotó al contorno de la zona de la pupila de una función elíptica. Se configuraron puertas lógicas para eliminar los falsos positivos con cambios anormalmente grandes y rápidos en el tamaño y la posición de la pupila detectada. El rendimiento de coincidencia de pupilas se cuantificó como el área de superposición entre la pupila de salida segmentada del ojo del ratón y una pupila de entrada circular virtual estática ubicada en la posición media de todos los puntos de datos. Al analizar la correlación con la locomoción del ratón, los datos de coincidencia de pupilas se promediaron en intervalos de tiempo de 1 s para alinear los datos de locomoción registrados simultáneamente.

Los protocolos del experimento para la medición del parpadeo y el cambio de la mirada fueron idénticos a la medición de la pupila, cuya única diferencia es que el SLO se centró en la capa de fibras nerviosas de la retina. Aquí, el evento de parpadeo se detectó en función de la intensidad media de la imagen de los fotogramas. Se consideró que un cuadro experimentaba un evento de parpadeo cuando la intensidad de su imagen estaba por debajo del 60% de la intensidad de imagen promedio de todo el video (Fig. S3). Implementamos un algoritmo de seguimiento de retina semiautomático escrito en Matlab para cuantificar las compensaciones globales de la imagen de retina SLO. Primero se seleccionaron manualmente tres plantillas de referencia diferentes con características bien definidas, como el disco óptico y las uniones de los vasos sanguíneos, a partir de una imagen de referencia (Fig. S4a). El tamaño y la ubicación de las plantillas fueron determinados por usuarios experimentados a través de una interfaz de usuario guiada. Las tres plantillas se utilizaron como referencia para realizar una correlación cruzada 2D con cada cuadro de imagen de la retina (Fig. S4b). El desplazamiento de la retina se determinó mediante uno de los tres desplazamientos relativos extraídos de la correlación cruzada 2D, que tiene el coeficiente de correlación normalizada (NCC) más grande (Fig. S4c). Se implementaron puertas Logit para eliminar puntos de fecha cuando se experimentan parpadeos.

Se utilizó un algoritmo de registro personalizado basado en tiras previamente informado para corregir la distorsión del movimiento en las imágenes AOSLO26. Brevemente, la imagen se separó en franjas a lo largo del eje de escaneo lento y cada franja se registró en la imagen de referencia individualmente con correlación cruzada 2D para corregir el efecto de corte inducido por los movimientos oculares rápidos. Aquí, el ancho de la franja seleccionada fue de 32 líneas (equivalente a una frecuencia de muestreo de 468 Hz), que está ligeramente por encima de la frecuencia de Nyquist del ancho de banda superior de los movimientos oculares de alta frecuencia (~200 Hz). Las tiras registradas con NCC menor que 0,5 se consideraron “registro fallido” y se eliminaron de la imagen registrada. Para registrar la imagen fluorescente, todas las imágenes se convolucionaron con un núcleo gaussiano 2D con \(\sigma =5\) píxeles antes del registro para mejorar el rendimiento de la correlación cruzada 2D para recuentos de fotones débiles.

El movimiento ocular de alta frecuencia y baja amplitud se midió con AOSLO escaneando un haz de imágenes 1D a través de un vaso sanguíneo importante de la retina a 15 kHz. Cuando existe movimiento ocular, el perfil espaciotemporal del vaso sanguíneo fotografiado se cortará (Fig. S5a derecha). La amplitud del componente del movimiento ocular ortogonal al vaso sanguíneo \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|\) se puede extraer como: \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|=\left|{{{{\bf{v}}}}}}\right|{{\sin }}(\theta )\), donde \(\theta\) es el ángulo entre el vaso sanguíneo y el eje de escaneo, y \(\left|{{{{\bf{v}}}}}}\right|\) es la cizalladura del perfil de los vasos sanguíneos en el espacio-tiempo (Fig. S5a izquierda ). Se utilizó un algoritmo totalmente automatizado para extraer la traza de corte similar al algoritmo de registro de tira para la corrección de movimiento, pero solo realiza una correlación cruzada 1D a lo largo de la dirección espacial. Primero se seleccionaron al azar veinte tiras de referencia con un ancho de 32 líneas de escaneo de la imagen espaciotemporal (Fig. S5b). Se realizó una correlación cruzada 1D a lo largo del eje espacial con cada tira de referencia para producir 20 trazas candidatas, que luego se alinearon normalizando a los valores medios. Los puntos de datos compensados ​​en los trazados candidatos tienen cambios mayores a 10 píxeles en comparación con el punto temporal anterior, se trataron como falsos positivos y se excluyeron del análisis futuro. Finalmente, los 20 rastros candidatos se fusionaron como el rastro de movimiento de salida final punto por punto calculando el valor mediano (Fig. S5c). Los rastros de movimiento extraídos se validaron mediante un examen visual realizado por un usuario experimentado al investigar las imágenes espacio-temporales registradas (Fig. S5d), las mediciones con imágenes mal registradas se consideraron "fallidas" y se eliminaron del análisis.

El flujo sanguíneo unicelular se midió de forma no invasiva en ratones despiertos utilizando un enfoque que se describió ampliamente en nuestra publicación anterior15. Brevemente, los vasos sanguíneos se escanearon oblicuamente en 1D (15 kHz) congelando el escáner lento (galvo) y los escaneos consecutivos se concatenaron a través del tiempo para formar una imagen espacio-temporal (Fig. S6a). Las células sanguíneas aparecen como rayas diagonales, lo que indica su posición en la exploración. La pendiente de la raya combinada con el ángulo entre la dirección del flujo y la posición del escaneo 1D (extraído de una imagen rasterizada 2D adquirida posteriormente) se utilizó en un algoritmo automatizado que emplea la transformada de radón para extraer la velocidad de las células sanguíneas. En nuestras imágenes espacio-temporales, las rayas que se acercan a una orientación vertical representan células de mayor velocidad. El algoritmo del radón opera dividiendo imágenes espacio-temporales en ROI superpuestas. Cada ROI se gira iterativamente 180° y se extrae una proyección de intensidad 1D para cada iteración. La desviación estándar se calculó para cada proyección 1D y el valor más alto indicó el ángulo dominante y, por lo tanto, produjo una velocidad para el ROI. El ancho de banda de medición de esta técnica fue de 0,03 a 1275 mm/s, lo que fue más que suficiente para medir velocidades biológicamente posibles de las células sanguíneas en la retina de un ratón que se comporta despierto. El flujo pulsátil se midió con alta resolución espaciotemporal y se superpuso como un mapa de color de velocidad en la imagen espacio-temporal (Fig. S6b). Para determinar el diámetro de la luz del vaso, se generaron imágenes de contraste de movimiento del vaso sanguíneo a partir de imágenes cartesianas 2D. La obtención de imágenes de luz directa y de dispersión múltiple a través de la columna de glóbulos rojos dentro de microvasos que abarcan <50 µm de tamaño ayudó a obtener una medición precisa del diámetro de la luz. Combinadas, las mediciones de velocidad y diámetro dieron el caudal medio (en µL/min) a través de cada recipiente. Estas mediciones se realizaron simultáneamente con las de los movimientos oculares descritos en la sección anterior. Las curvas del modelo de diámetro de flujo se ajustaron a los datos medidos en comparación con las dos poblaciones. Brevemente, el modelo utilizado fue de la forma y = axb. donde y es el caudal (μL/min) y x es el diámetro (μm).

La medición del espesor de la retina se realizó con HRA OCT. Se utilizó el modo de "seguimiento" para realizar imágenes longitudinales en la misma ubicación de la retina con el primer punto temporal como referencia. El espesor total de la retina (TRT) se definió como la distancia entre el límite de la membrana limitante vítreo-interna (vítreo-ILM) y el límite del segmento externo-epitelio pigmentario de la retina (OS-RPE) (Fig. S7a, b). En el análisis se enmascaró una región circular centrada en el disco óptico con un grado visual de 8 °, que es difícil de segmentar (Fig. S7c). Las capas fueron detectadas mediante un algoritmo de segmentación de programación dinámica de teoría de grafos personalizado basado en la estrategia informada previamente por la ref. 48.

Todos los datos del estudio actual provienen de 12 ratones con el fondo C57BL/6 J de la población de Jackson Labs (Bar Harbor, ME) (CX3Cr1, thy-1 YFP, cepa B6). Se tomaron imágenes de los ratones directamente de los laboratorios de Jackson o en algunas generaciones de progenie de colonias de los ratones fundadores originales. Todas las mediciones en el estudio se realizaron varias veces en el mismo ratón (p. ej., figuras 2-4, 6-9) o en varios ratones para comparar. Al comparar dos momentos o grupos diferentes, las diferencias se evaluaron basándose en una prueba t pareada simple para comparar condiciones. Las pruebas estadísticas se realizaron en Matlab® y se informaron con el umbral de significancia que cumplía con los valores de p *p < 0,1, **p < 0,05. Se informan los valores de p reales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen detrás de las cifras se incluyen en los archivos de Datos complementarios 1 a 7. Los datos SLO procesados ​​y los videos AOSLO y OCT sin procesar están disponibles en un repositorio público (Zenodo): https://doi.org/10.5281/zenodo.7806898. Los autores pueden proporcionar datos adicionales previa solicitud razonable.

Los archivos de impresión 3D de la configuración del mouse con cabeza sujeta y todos los códigos para el procesamiento de datos están disponibles en el repositorio público (GitHub): https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.

Remtulla, S. & Hallett, PE Un ojo esquemático para el ratón y comparaciones con la rata. Vis. Res. 25, 21-31 (1985).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nair, G. y col. Efectos de los anestésicos comunes sobre el movimiento ocular y el electrorretinograma. Doc. Oftalmol. Adv. Oftalmol. 122, 163-176 (2011).

Artículo de Google Scholar

Hawes, NL, Smith, RS, Chang, B., Davisson, M. y Heckenlively, JR Fotografía y angiografía del fondo de ojo del ratón: un catálogo de fenotipos normales y mutantes. Mol. Vis. 5, 22 (1999).

Paques, M. et al. Imágenes de fondo de ojo de alta resolución mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal en el ratón. Vis. Res. 46, 1336-1345 (2006).

Artículo PubMed Google Scholar

Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U. y Cardin, JA La excitación y la locomoción contribuyen de forma distinta a los patrones de actividad cortical y la codificación visual. Neurona 86, 740–754 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chockanathan, U. et al. Los cambios en las correlaciones por pares durante la carrera remodelan el estado de la red global en el bulbo olfativo principal. J. Neurofisiol. 125, 1612-1623 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Dombeck, DA, Khabbaz, AN, Collman, F., Adelman, TL y Tank, DW Imágenes de actividad neuronal a gran escala con resolución celular en ratones despiertos y móviles. Neurona 56, 43–57 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thrane, AS y cols. La anestesia general altera selectivamente la señalización de calcio de los astrocitos en la corteza del ratón despierto. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 109, 18974–18979 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rakymzhan, A., Li, Y., Tang, P. y Wang, RK Diferencias en la vasculatura y el flujo de la sangre cerebral en la corteza del ratón despierto y anestesiado reveladas por angiografía por tomografía de coherencia óptica cuantitativa. J. Neurosci. Métodos 353, 109094 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cang, J., Kalatsky, VA, Löwel, S. y Stryker, MP Imágenes ópticas de la señal intrínseca como medida de la plasticidad cortical en el ratón. Vis. Neurociencias. 22, 685–691 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaneko, M., Fu, Y. & Stryker, MP La locomoción induce una mejora de la respuesta específica al estímulo en la corteza visual adulta. J. Neurosci. 37, 3532–3543 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calderone, L., Grimes, P. & Shalev, M. Catarata aguda reversible inducida por xilazina y por anestesia con ketamina-xilazina en ratas y ratones. Exp. Res. ocular. 42, 331–337 (1986).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Xiong, J. y col. El isoflurano produce disminuciones marcadas y no lineales en los umbrales de vasoconstricción y escalofríos. Anestesiología 85, 240–245 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Geng, Y. et al. Imágenes de retina con óptica adaptativa en el ojo de un ratón vivo. Biomédica. Optar. Expreso 3, 715 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Joseph, A., Guevara-Torres, A. & Schallek, J. Imágenes del flujo sanguíneo unicelular desde los vasos más pequeños a los más grandes de la retina viva. eLife 8, e45077 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guevara-Torres, A., Joseph, A. & Schallek, JB Medición sin etiquetas del flujo de células sanguíneas de la retina, la velocidad, el hematocrito y el ancho de los capilares en el ojo de un ratón vivo. Biomédica. Optar. Expreso 7, 4228–4249 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Warner, EJ y Padmanabhan, K. Diferencias de sexo en el comportamiento de carrera voluntaria con la cabeza fija en ratones C57BL/6J. EUR. J. Neurosci. 51, 721–730 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Paster, EV, Villines, KA & Hickman, DL Criterios de valoración para modelos de tumores abdominales en ratones: refinamiento de los criterios actuales. comp. Medicina. 59, 234–241 (2009).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Barteselli, G. y col. Precisión del espectro de Heidelberg en la alineación entre la imagen del infrarrojo cercano y la exploración tomográfica en un ojo modelo: un estudio multicéntrico. Soy. J. Oftalmol. 156, 588–592 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, MTM y cols. Impacto del parpadeo en la superficie ocular y los parámetros de la película lagrimal. Ocul. Navegar. 16, 424–429 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Sakatani, T. & Isa, T. Análisis cuantitativo de movimientos oculares rápidos espontáneos en forma de sacada en ratones C57BL/6. Neurociencias. Res. 58, 324–331 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Yarbus, AL Movimientos oculares y visión (Plenum Press, 1967).

Jeon, CJ, Strettoi, E. y Masland, RH Las principales poblaciones de células de la retina del ratón. J. Neurosci. 18, 8936–8946 (1998).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dubra, A. & Harvey, Z. Registro de imágenes 2D de instrumentos oftálmicos de escaneo rápido. En: Registro de imágenes biomédicas, WBIR 2010, Vol 6204, (eds. Fischer, B., Dawant, BM & Lorenz, C.). Apuntes de conferencias sobre informática (Springer, Berlín, Heidelberg, 2010).

Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H. & Williams, DR Morfología y topografía de pericitos retinianos en la retina de ratón vivo utilizando imágenes de óptica adaptativa in vivo y caracterización ex vivo. Investigando. Oftalmol. Vis. Ciencia. 54, 8237 (2013).

Artículo de Google Scholar

Yang, Q. y col. Estabilización óptica de circuito cerrado y registro de imágenes digitales en oftalmoscopia de luz de escaneo con óptica adaptativa. Biomédica. Optar. Expreso 5, 3174–3191 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bedggood, P. & Metha, A. Análisis de señales de movimiento y contraste generadas por los componentes de la sangre humana en el flujo capilar. Optar. Letón. 39, 610–613 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Irvin, CG & Bates, JHT Medición de la función pulmonar en el ratón: el desafío del tamaño. Respirar. Res. 4, 4 (2003).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Butz, GM y Davisson, RL Medición telemétrica a largo plazo de parámetros cardiovasculares en ratones despiertos: una herramienta de genómica fisiológica. Fisiol. Genómica 5, 89–97 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ko, H.-K., Snodderly, DM y Poletti, M. Movimientos oculares entre sacádicas: medición de la deriva ocular y el temblor. Vis. Res. 122, 93-104 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Prusky, GT, West, PWR y Douglas, RM Evaluación conductual de la agudeza visual en ratones y ratas. Vis. Res. 40, 2201–2209 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, P. y col. Promedio temporal de moteado de volúmenes de tomografía de coherencia óptica para imágenes de retina vascular y neuronal con resolución celular in vivo. Neurofotónica 6, 041105 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, X., Bedggood, P. y Metha, A. Limitaciones de la calidad de imagen de la óptica adaptativa en ojos de roedores. Biomédica. Optar. Expreso 3, 1811–1824 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Guevara-Torres, A., Williams, DR & Schallek, JB Imágenes de cuerpos celulares translúcidos en la retina de un ratón vivo sin agentes de contraste. Biomédica. Optar. Expreso 6, 2106–2119 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiao-Ping, Y. et al. Evaluación ecocardiográfica de la función cardíaca en ratones conscientes y anestesiados. Soy. J. Physiol. Círculo del corazón. Fisiol. 277, H1967-H1974 (1999).

Joseph, A., Chu, CJ, Feng, G., Dholakia, K. y Schallek, J. Imágenes sin etiquetas de la dinámica de las células inmunitarias en la retina viva utilizando óptica adaptativa. eLife 9, e60547 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choi, W. y col. Medición del flujo sanguíneo total pulsátil en la retina humana y de rata con OCT espectral/de dominio de Fourier de velocidad ultraalta. Biomédica. Optar. Expreso 3, 1047–1061 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhi, Z., Cepurna, WO, Johnson, EC, Morrison, JC y Wang, RK Impacto de la presión intraocular en los cambios del flujo sanguíneo en la retina, la coroides y la cabeza del nervio óptico en ratas investigadas mediante microangiografía óptica. Biomédica. Optar. Expreso 3, 2220–2233 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiu, Y., Yang, H. y Lei, B. Efectos de tres anestésicos de uso común sobre la presión intraocular en ratones. actual. Res. ocular. 39, 365–369 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B. & Blümel, G. Un estudio comparativo con varios anestésicos en ratones (pentobarbitona, ketamina-xilazina, carfentanilo-etomidato). Res. Exp. Medicina. 184, 159-169 (1984).

Artículo CAS Google Scholar

Intoy, J. & Rucci, M. Los movimientos oculares finamente afinados mejoran la agudeza visual. Nat. Comunitario. 11, 795 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niell, CM y Stryker, MP Campos receptivos altamente selectivos en la corteza visual del ratón. J. Neurosci. 28, 7520–7536 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahn, J., Rueckauer, B., Yoo, Y. & Goo, YS Nuevas características de los campos receptivos en la retina del ratón a través de la covarianza activada por picos. Exp. Neurobiol. 29, 38–49 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Tring, E., Duan, KK y Ringach, DL Los dominios ON/OFF dan forma a la estructura del campo receptivo en la corteza visual del ratón. Nat. Comunitario. 13, 2466 (2022).

Mineault, PJ, Tring, E., Trachtenberg, JT y Ringach, DL Resolución espacial mejorada durante la locomoción y mayor atención en la corteza visual primaria del ratón. J. Neurosci. 36, 6382–6392 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levy, DL, Sereno, AB, Gooding, DC y O'Driscoll, GA Disfunción del seguimiento ocular en la esquizofrenia: caracterización y fisiopatología. actual. Arriba. Comportamiento. Neurociencias. 4, 311–347 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chiu, C.-J. & Taylor, A. Hiperglucemia dietética, índice glucémico y enfermedades metabólicas de la retina. Prog. Retin. Res. ocular. 30, 18–53 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Srinivasan, PP, Heflin, SJ, Izatt, JA, Arshavsky, VY y Farsiu, S. Segmentación automática de hasta diez límites de capas en imágenes SD-OCT de la retina del ratón con y sin capas faltantes debido a patología. Biomédica. Optar. Expreso 5, 348–365 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

El laboratorio Schallek cuenta con el respaldo del Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud bajo R01 EY028293 y P30 EY001319. Padmanabhan cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01 MH113924, P50 HD103536 y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) CAREER 1749772. La investigación también fue respaldada por una subvención sin restricciones para el Departamento de Oftalmología de la Universidad de Rochester, un Premio de Desarrollo Profesional, un premio Career Advancement Award y un premio Stein de Research to Prevent Blindness (RPB), Nueva York, Nueva York; el Premio de Neuroimagen David Mahoney de la Fundación Dana y una beca de investigación de Genentech Inc. (Schallek).

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14620, EE. UU.

Guanping Feng y Kosha Dholakia

Centro de Ciencias Visuales, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14627, EE. UU.

Guanping Feng, Aby Joseph, Kosha Dholakia, Fei Shang, Charles W. Pfeifer, Derek Power, Krishnan Padmanabhan y Jesse Schallek

Instituto de Óptica, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14620, EE. UU.

Para que José

Departamento de Neurociencia, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

Fei Shang, Krishnan Padmanabhan y Jesse Schallek

Flaum Eye Institute, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

Charles W. Pfeifer y Jesse Schallek

Centro de Investigación sobre Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

Krishnan Padmanabhan

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

JS concibió este estudio. KP proporcionó la idea y el diseño de la preparación y configuración del mouse con sujeción para la cabeza. GF, AJ, KD, FS, CWP, DP y JS diseñaron y realizaron experimentos. GF, AJ y FS analizaron e interpretaron los datos. GF, AJ, KD, FS, DP y JS escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Jesse Schallek.

El laboratorio fue financiado en parte por una subvención de investigación colaborativa de Genentech Inc. Jesse Schallek posee patentes estadounidenses sobre tecnología de imágenes oftálmicas a través de la Universidad de Rochester. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a Thomas J. Gast y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Joao Valente. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Feng, G., Joseph, A., Dholakia, K. et al. Imágenes de retina estructurales y funcionales de alta resolución en el ratón que se comporta despierto. Común Biol 6, 572 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

Descargar cita

Recibido: 18 de mayo de 2022

Aceptado: 02 de mayo de 2023

Publicado: 29 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.